Seriál: ROZMNOŽOVÁNÍ ROSTLIN
Růst pylové láčky
BONUS: Růst pylové láčky od opylení k oplození

Vývoj a funkce samčího gametofytu krytosemenných rostlin představuje komplexní sled na sebe navazujících procesů, který vyžaduje koordinovanou spolupráci rozličných buněčných typů a pletiv a s tím související specifickou genovou expresi. Na tomto procesu se podílejí pletiva gametofytická (mikrospora, zrající pylové zrno, pylová láčka) i sporofytická (prašník, tapetum, vodicí pletiva čnělky). Gametofytickou vývojovou fázi je možno rozdělit na dvě na sebe navazující období, vývojové a funkční.

Vývojová fáze se odehrává v prašných pouzdrech a je ukončena uvolněním zralých pylových zrn z prašníků. Je pro ni charakteristická funkční specializace dvou buněčných typů - vegetativní buňky a samčích gamet, buněk spermatických, které představují samčí zárodečnou linii. Tento proces je podložen dvěma na sebe navazujícími buněčnými děleními a v jeho průběhu dochází k výraznému morfologickému i fyziologickému rozrůznění zmíněných buněk doprovázenému masivní syntézou buněčné stěny pylového zrna a ukládáním řady ochranných a zásobních látek. Právě tomuto období jsme se věnovali v předchozím článku „Vývoj pylu: od mikrosporocytu ke zralému pylovému zrnu“.

Funkční neboli progamická fáze začíná přenesením pylu na bliznu, pokračuje jeho klíčením, růstem pylové láčky a končí dvojitým oplozením. Ani tento proces nepostrádá na zajímavosti a mimo vlastního bouřlivého růstu pylové láčky - pylová láčka je nejrychleji rostoucí buňkou rostlinného těla - je v současné době vysoce aktuálním tématem aktivace pylu pletivy pestíku a komunikace mezi oběma gametofyty, samčím a samičím.

Klíčení pylu
K opylení dochází v okamžiku dosednutí pylového zrna na povrch kompatibilní blizny. Prvním krokem aktivace pylu je jeho rehydratace, na jejímž konci se v oblasti apertury (klíčního póru) objeví špička pylové láčky (
Obr. 1). Hydratace pylového zrna je navíc doprovázena masivním příjmem aminokyselin, zejména prolinu, enzymů typu esteráz, kataláz, nukleáz, celulázy a pektinázy. Zprostředkovatelem příjmu vody při hydrataci spojené se změnou buněčné organizace a architektury membránových struktur se zdají být akvaporiny, z nichž některé vykazují pylově specifickou expresi. Prominentním procesem během rehydratace je formování velkého množství vesikulů (váčků), lipidových kapének a vakuol. Zároveň dochází k rapidnímu zvýšení respirační aktivity mitochondrií. Dvojbuněčná pylová zrna mají strukturně jednoduché mitochondrie, ve kterých se v průběhu aktivace pylu objevují početné kristy. Trojbuněčný pyl se naproti tomu vyznačuje přítomností vysoce organizovaných mitochondrií, které se v průběhu aktivační fáze adaptují bez dalších morfologických změn. Během aktivace pylu dále u většiny druhů dochází k formování polysomů, obnovení silné transkripční a zejména translační aktivity, změnám cytoskeletu a zvýšené aktivitě diktyosomů. Aktinová filamenta, jejichž přítomnost je pro vyklíčení pylu nezbytná, jsou v aktivovaném pylu uspořádána směrem k místu vypučení budoucí pylové láčky podobně jako gradient vápenatých iontů. Méně je známo o úloze mikrotubulů, neboť tyto nejsou organizovány v budoucích klíčních pórech, nicméně krátké a větvené mikrotubuly se soustřeďují do podoby límce okolo báze postupně se objevující pylové láčky. Rozbití mikrotubulů pomocí cytoskeletálních jedů má jen velice malý či dokonce žádný efekt na klíčení pylu.

Pylová zrna obsahují větší či menší množství skladovaných mRNA, které kódují bílkoviny potřebné pro vyklíčení pylu a růst pylové láčky. Skladované mRNA se v pylových zrnech vyskytují ve vazbě na řadu strukturních a regulačních proteinů (
Obr. 2) ve formě tzv. skladovaných ribonukleoproteinových částic. Potřeba transkripce a translace pro vyklíčení a růst pylové láčky je u různých druhů různá. U řady zkoumaných druhů bylo zjištěno, že aplikace inhibitoru transkripce, aktinomycinu D, nemá na klíčení pylu ani růst láček in vitro žádný vliv. Naproti tomu aplikace cykloheximidu jako inhibitoru translace má bezprostřední a fatální vliv na klíčení pylu i na růst pylových láček, což ukazuje na zásadní potřebu masivní syntézy bílkovin pro zajištění růstu pylových láček. Bylo prokázáno, že i modelový druh huseníček Thalův (Arabidopsis thaliana) se chová dle tohoto schématu, alespoň v počátečních fázích růstu pylové láčky in vitro. Pro zdárný průběh oplození in vivo je však nezbytná specifická aktivace transkripce v důsledku interakcí pylové láčky s pletivy pestíku. Naproti tomu jiný model, tabák, vyžaduje pro splnění své biologické úlohy také aktivní transkripci i v podmínkách in vitro. U tabáku dokonce dochází k aktivaci přepisu některých specifických transkriptů až po proběhnutí druhé pylové mitosy po více než 13 hodinách kultivace in vitro. Není bez zajímavosti, že klíčení tříbuněčného pylu některých druhů není nijak ovlivněno zablokováním translace, což ukazuje, že tento pyl obsahuje kompletní sadu bílkovin potřebnou pro růst pylových láček.
Cesta do pravěku
Růst pylové láčky
Po proběhnutí všech důležitých změn spojených s hydratací a aktivací pylového zrna se v klíčním póru objeví pylová láčka, jejímž úkolem je prorůst vodicími pletivy čnělky až k semeníku, kde, nadále po povrchu septa, doroste až k vajíčku (
Obr. 3). Do něho vnikne otvorem klovým (mikropyle), je dále naváděna až k samičímu gametofytu, kde kontrolovaně pukne a uvolní obě samčí gamety pro vlastní dvojí oplození.
V průběhu procesu hydratace a aktivace se vegetativní buňka extrémně polarizuje, což je spojeno s reorganizací a migrací organel, zejména Golgiho aparátu a velkého množství vesikulů, směrem ke klíčnímu póru a posléze špičce rostoucí pylové láčky. Rostoucí pylové láčky představují unikátní typ rostlinných buněk, a to zejména pro svou výjimečnou růstovou polaritu a rychlost růstu (
Obr. 4). Proto vedle kořenových vlásků, vláken bavlníku, houbových hyf či prvoklíčků mechorostů slouží jako výtečný model pro studium buněčného růstu mechanismem polárního vrcholového růstu. Ten může u kukuřice dosáhnout rychlosti až jednoho centimetru za hodinu. Schopnost vrcholového růstu je podpořena polarizovaným uspořádáním cytoplasmy. Právě proto jsou pylové láčky vhodným studijním materiálem i pro analýzy buněčné kompartmentalizace, metabolických drah a dynamiky ukládání buněčné stěny.
Cesta do pravěku
Pro morfologii polarizované pylové láčky je charakteristické asymetrické uspořádání buněčných organel, jež v důsledku proudění cytoplasmy vykazují specifický pohyb popisovaný jako „obrácená fontána“. Růst pylových láček je oscilační a je korelován s oscilací příjmu vápenatých, vodíkových a draselných kationtů a chloridových aniontů. V této souvislosti nepřekvapí objev řady silně exprimovaných a často pylově specifických genů kódujících odpovídající membránové přenašeče, jejichž vyřazení může mít pro správnou funkci pylové láčky fatální důsledky. Apikální (vrcholová) oblast rostoucí pylové láčky nazývaná „clear zone“ obsahuje téměř výhradně transportní vesikuly umožňující sekreci a endofytickou aktivitu potřebnou pro rychlou buněčnou expanzi právě v oblasti špičky spojenou se syntézou buněčné stěny, která je dokončena po reorganizaci jednotlivých komponent v subapikální oblasti. Větší organely bývají uloženy distálněji od subapikálních oblastí cytoplasmy. V této oblasti bývá lokalizován i komplex vegetativního jádra v těsné fyzické vazbě s oběma buňkami spermatickými tak, jak byl vytvořen po ukončení druhé pylové mitosy. Zmíněný komplex se anglicky nazývá „male germ unit“ (MGU) a zastává naprosto zásadní úlohu nejen při dopravě spermatických buněk k vajíčku, ale zejména v přímé komunikaci mezi buňkami a jejich jádry náležejícími k somatické a zárodečné linii a snad i v regulaci jejich genové exprese. Výsledky popsaných ultrastrukturních studií byly potvrzeny i pozorováním živých pylových láček exprimujících bílkoviny asociované s jednotlivými organelami a značené zeleným fluorescenčním proteinem původem z medúz (angl. green fluorescent protein, GFP). Kompartmentace organel je stejně jako jejich pohyb podmíněna zejména propracovanou strukturou aktinového cytoskeletu a jeho zřetelnými strukturálními a dynamickými vlastnostmi v jednotlivých oblastech, jak bylo prokázáno mimo jiné řadou pokusů s látkami inhibujícími polymerizaci aktinových filament. Zatímco úloha mikrofilament v dálkovém vesikulárním transportu i kompartmentaci pylové láčky je poměrně probádaná, funkce mikrotubulů v pylových láčkách zůstává z velké míry nejasnou. V této souvislosti je důležitý fakt, že apikální růst pylových láček krytosemenných rostlin je aplikací inhibitorů tvorby mikrotubulů ovlivněn jen minimálně, avšak přítomnost mikrotubulů je nezbytná pro schopnost udržení směru růstu pylové láčky in vitro. Co se zdá být jasné, je úloha mikrotubulů v udržování komplexu MGU a jeho koordinované migraci v cytosolu pylové láčky. U nahosemenných rostlin se navíc mikrotubuly podílejí na růstu pylových láček koordinovaně s aktinovým cytoskeletem. Mezi typem růstu pylových láček nahosemenných a krytosemenných rostlin vůbec existují podstatné rozdíly, jsou ostatně zcela odlišnými strukturami jak z morfologického, tak z evolučního hlediska.
Cesta do pravěku
Současné znalosti biologie pylových láček jsou do značné míry založeny na pokusech s pylovými láčkami kultivovanými in vitro. Pylové láčky ovšem intimně interagují s okolními pletivy a vodící pletivo hraje významnou roli v procesech vzájemného rozeznání kompatibilního pylu a blizny a následného vedení pylové láčky k vajíčku. Během své cesty k vajíčku (Obr. 5) pylové zrno i pylová láčka intenzivně vzájemně komunikují jak s rozličnými sporofytickými maternálními pletivy (Obr. 6), tak s buňkami samičího gametofytu (Obr. 7). Díky pokroku v oblasti buněčné a molekulární biologie a možnostem studia v podmínkách in vivo a semi-in vivo byla již popsána řada signálních molekul i příslušných receptorů. Kompatibilní interakce jsou zajištěny prostřednictvím složitých drah zahrnujících řadu faktorů, například krátké sekretované polypeptidy, bílkoviny bohaté cysteinem, glykoproteiny, pektiny, flavonoidy, ?-aminomáselná kyselina a gradient vápenatých iontů. Přes tyto dílčí pokroky však právě podrobné popsání komunikace mezi samčími a samičími pletivy před oplozením a kaskád signalizačních drah představuje v současné době jednu z nejaktuálnějších výzev v oblasti pohlavního rozmnožování rostlin. Šíře a zajímavost této problematiky však překračuje rozsah tohoto textu, můžeme se k ní však vrátit někdy v budoucnu.
Legenda k obrázkům
Obr. 1. Klíčící pylové zrno zimolezu (Lonicera sp.) zobrazené pomocí skenovací elektronové mikroskopie
Obr. 2. Zviditelnění dvou regulačních proteinů v pylu Arabidopsis thaliana. Zde jsou modře označena jádra nesoucí genetickou informaci a zeleně a červeně jsou nezávisle zobrazeny dvě konkrétní regulační bílkoviny ovlivňující v pylových zrnech expresi dalších genů, které jsou blíže studovány v Laboratoři biologie pylu. Žlutá barva pak znázorňuje místa, zejména v bezprostředním okolí buněčných jader, kde oba proteiny lokalizují společně.
Obr. 3. Schématické znázornění rostoucí pylové láčky v pletivech semeníku.
Obr. 4. Vrcholově rostoucí pylové láčka Arabidopsis thaliana. Buněčná stěna pylových láček je tvořena zvláštním polysacharidem, kalózou, a její zviditelnění, zejména ve špičce, je možné specifickým barvením anilinovou modří.
Obr. 5. Oplození vajíček Arabidopsis thaliana pylovými láčkami. Modré tečky ukazují každé oplozené vajíčko. Modrá barva je výsledkem aktivity enzymu beta-glukuronidázy (GUS), který je schopen konvertovat bezbarvý substrát na modře zbarvený produkt, a to pouze v buňkách, ve kterých je tento enzym přítomen. My jsme pro oplození použili pyl specificky exprimující enzym GUS, a proto můžeme přesně stopovat rostoucí pylovou láčku až na místo, kde při oplození vajíčka pukne, její buněčný obsah se rozleje a dojde k vlastnímu dvojitému oplození. Právě proto vidíme ony modré tečky.
Obr. 6. Soubor pylových láček Arabidopsis thaliana rostoucích semeníkem k vajíčkům a obarvených anilinovou modří.
Obr. 7. Komunikace pylové láčky s vajíčkem. Pylová láčka je k vajíčku naváděna gradientem signalizačních molekul, zde znázorněným oranžovými tečkami (A). Po dosažení vajíčka pak pukne (B) a uvolní obě samčí pohlavní buňky (spermatické buňky) a umožní tak dvojité oplození.




Autor:
doc. RNDr. David Honys, Ph.D.
Laboratoř biologie pylu, Ústav experimentální botaniky AV ČR

Foto a kresby: (1) David Honys, (2) Alena Náprstková, (3, 7) Barbora Honysová, (4, 5) Said Hafidh, (6) Jan Fíla

Celý článek ke stažení v pdf zde: Honys, NB 2018/1

Další zajímavé informace z vědeckého výzkumu si přečtete v tištěné či e-verzi časopisu Nová Botanika 2018/1.
Víte že, rostoucí pylové láčky mají úžasnou rychlost růstu, která může např. u kukuřice dosáhnout až jednoho centimetru za hodinu?



Cesta do pravěku

Objevujte zajímavosti rostlinné říše

s časopisem Nová Botanika

Copyright © 2018 Botanica Nova, z.s., Časopis Nová Botanika. All Rights Reserved

Předplatné

Jak objednat časopis


PŘEDPLATNÉ I JEDNOTLIVÁ ČÍSLA V TIŠTĚNÉ I ELEKTRONICKÉ VERZI MŮŽETE OBJEDNÁVAT:

• on-line na e-shopu MujSvetRostlin.eu
• e-mailem na adrese redakce
redakce@novabotanika.eu nebo predplatne@novabotanika.eu a objednavky@mujsvetrostlin.eu
• v síti vybraných distributorů

Roční předplatné


TIŠTĚNÁ VERZE
Cena ročního předplatného je 300 Kč
BONUS PRO PŘEDPLATITELE
• elektronická verze ZDARMA (na CD spolu s posledním číslem ročníku)
JEDNOTLIVÁ ČÍSLA
Pokud si budete přát, můžeme vám zaslat vybraná čísla časopisu jednotlivě.
• jednotlivá čísla 99 Kč (plus poštovné) 

Elektronická verze


ELEKTRONICKÁ VERZE
Cena ročního předplatného je 85 Kč
JEDNOTLIVÁ ČÍSLA
V elektronické verzi jsou k dispozici všechna vydaná čísla časopisu:
• pravidelná čísla 49 Kč